Invitrogen反转录酶III是SuperScript®IIRT的突变体,在50°C下具有活性,半衰期为220分钟。使用基因特异性引物(GSPs)时能提供更高的特异性,并且在所有反转录酶中产生最高的cDNA产量。它适用于特定基因的RT-PCR,或从总RNA或poly(A)+RNA样品中生成cDNA。与SuperScript®II一样,它能从单链RNA、DNA或RNA:DNA杂交体合成互补DNA链。SuperScript®IIIRT通过引入点突变进行基因工程改造,这些突变延长了半衰期、降低了RNase活性并提高了热稳定性。 •热稳定性–在50°C下半衰期为220分钟
•产量–降低的RNaseH活性,产生更多全长cDNA
•特异性–在50°C下具有活性,使用基因特异性引物时特异性更高
•应用–芯片标记、cDNA文库构建、RT-PCR、引物延伸以及3'和5'RACE
来源:从表达M-MLVpol基因(1,2)的大肠杆菌中纯化,经过诱变处理以提高热稳定性和半衰期,并降低RNaseH活性。
性能和质量检测:SDS-PAGE纯度检测;内切脱氧核糖核酸酶、外切脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶检测(图2)以及cDNA产物的产量和长度检测。
单位定义:一个单位的SuperScript®IIIRT是指在37°C下,以poly(A)•oligo(dT)12-18为模板•引物,10分钟内将1nmol脱氧核糖核苷酸掺入酸沉淀物质所需的酶量(3)。
单位反应条件:50mMTris-HCl(pH8.3)、40mMKCl、6mMMgCl₂、1mMDTT、0.5mM[³H]dTTP、0.1mMpoly(A)、0.1mMoligo(dT)12-18、0.1mg/mlBSA,以及酶,总体积50µl,在37°C下反应10分钟。