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PCR引物设计原则简介

2025年12月30日 09:31:39      来源:上海嘉鹏科技有限公司 >> 进入该公司展台      阅读量:1

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实验步骤

先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) ,再次引物与引物之间避免形成稳定的聚体或发夹结构。引物设计应注意如下要点:

1.引物的长度般为15-30 bp,常用的是18-27 bp。

2.引物序列在模板内应当没有相似性较,尤其是3’端相似性较的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。

3.引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

4.引物序列的GC 含量般为40-60%,过或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5.引物的另个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。合理的退火温度从55℃到70℃。为获得结果,两个引物应具有近似的Tm值。

6.引物聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。应该尽量避免。

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