组织固定与保存
快速固定：收获组织后立即用冷固定液（如4%多聚甲醛）处理，减少探针降解和非特异性结合。
长期保存：固定后的组织可置于-80℃冰箱或液氮中，避免反复冻融。
切片制备
石蜡切片：适用于免疫组化（IHC），需经脱水、透明、包埋等步骤，切片厚度通常为4-5μm。
冰冻切片：适用于免疫荧光（IF），可保留更多抗原活性，切片厚度为6-10μm。
三、染色观察
封闭与抗原修复
封闭：用5%BSA或脱脂奶粉封闭切片，减少非特异性结合，封闭时间15-60分钟。
抗原修复：石蜡切片需经热修复（如柠檬酸缓冲液，95℃加热10-15分钟）或酶修复（如蛋白酶K），以暴露抗原表位。
抗体孵育
一抗：使用缺氧探针特异性抗体，稀释比例通常为1:100-1:500，4℃孵育过夜。
二抗：根据实验需求选择荧光标记或酶标记二抗，室温孵育1-2小时。
显色与成像
免疫组化：使用DAB或AEC显色，通过显微镜观察棕色或红色沉淀，定位缺氧区域。
免疫荧光：用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察荧光信号，如绿色荧光（FITC标记）或红色荧光（Cy3标记）。
流式细胞术：将细胞与探针共孵育后，通过流式细胞仪检测荧光强度，定量分析缺氧细胞比例。
