大咖讲堂 - 相干拉曼散射显微术Ⅰ-全球贸易网

“一花一世界”，这句充满禅意的话在微观视野中得到诠释。而构成世间万千纷繁的原子由化学键联合为分子，不同的分子往往具有特异性的化学键振动，成为它们的指纹特征。相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering，CRS）显微术便是通过探测目标分子的特征振动来提供成像所需的衬度, 同时基于非线性光学过程大大增强拉曼散射的信号，提高成像速率以及检测灵敏度的新型显微技术^[1][2]。

▲水分子的三种振动模式示意

▲图 1.水稻花粉的受激拉曼显微成像图（红：脂质；绿：淀粉；蓝：蛋白）[3]

常见的光谱学手段按跃迁类型可分为两大类：电子光谱和振动光谱。电子光谱涉及电子在不同能级间的跃迁（如吸收光谱和荧光光谱等）；振动光谱则作用于化学键或声子的振动（如红外吸收谱和拉曼散射谱）。如果把电子光谱比作静如处子但威力强大的内功；振动光谱则好似动如脱兔、招式鲜明的外家拳（见水分子振动示意图）。红外谱为直接共振吸收，信号很强但波长较长（中远红外），不利于含水环境的高分辨生物成像；我们通常讲的拉曼散射指自发拉曼散射过程，信号非常弱（比荧光低 8-10 个数量级），无法用于快速成像。相干拉曼是增强拉曼的手段之一，利用短脉冲激光的非线性效应实现增强，具有的优势和应用前景。

简单概括，相干拉曼散射显微术具有如下优点：

免标记和分子特异性：CRS 成像的信号来源于目标分子本身，无需外源标记物，也避开了药物小分子等不易标记的问题，在活体（in vivo）观测上更具有优势；可对具有不同拉曼谱的分子进行选择性成像，比如生物样品里常见的脂质、蛋白、核酸和糖类等（如图 1）；
较高的探测灵敏度：相比于自发拉曼，成像速度一般有 3-5 个数量级的提升，一定条件下可实现视频成像速度（每秒几十帧）；
光学层析和三维扫描：类似多光子显微镜的光学层析和三维成像功能；且由于所用的激发波长一般在近红外，有较好的穿透深度和更小的光毒性。

根据非线性光学过程的不同，可将相干拉曼散射分为两种：相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）。虽然这两种非线性光学现象很早就被发现（上世纪 60 年代），但长期仅作为光谱学测量手段，直到 1999 年以及 2008 年，哈佛大学谢晓亮教授才分别将它们以实用显微成像技术推广开来^[4][5]。

▲图 2. 自发拉曼散射、受激拉曼散射以及相干反斯托克斯拉曼散射的能级示意图

自发与相干拉曼散射的能级示意图见图 2。自发拉曼只需要一束激发光，称为泵浦光（ω_p），泵浦光子与分子发生非弹性碰撞，将部分能量转移给分子振动。因此散射出来的光相对于泵浦光将发生一系列的频率红移，称为斯托克斯光（ω_s），对应到光谱仪中的一系列谱峰，成为该分子的指纹特征。泵浦和斯托克斯光子的频率差正好共振于化学键的振动频率（Ω=ω_p-ω_s），满足能量守恒。对于相干拉曼散射，需将泵浦和斯托克斯这两束激光同时作用于分子，当它们的频率差（拍频）共振于某个化学键的振动时，大量分子的同一个振动模式将被同步（相干地）激发起来，使得散射效率得到大大地增强。最终表现为：泵浦光减弱（受激拉曼损失，SRL）、斯托克斯光增强（受激拉曼增益，SRG），并且出现反斯托克斯（ωas=2ωp-ωs）的新频率分量（CARS）。自发拉曼散射与荧光、吸收等同属线性光学范畴，一般使用连续激光即可。相干拉曼与双光子荧光、二次谐波等都属非线性光学范畴，需使用超短脉冲激光。见的用于相干拉曼的光源是皮秒光参量振荡器（OPO），输出两路皮秒光，一束波长固定（如 1064nm），另一束波长在近红外区间可调，它们分别作为斯托克斯和泵浦光。调节激光波长使得我们可以改变待测拉曼频率，选择性地去探测不同的化学键/分子。

CARS 与 SRS 虽然都是三阶非线性光学过程，它们之间有明显的区别：CARS 是个四波混频过程，产生的光子具有第三种频率——反斯托克斯光子 ω_as，因此只需采用合适的滤波片就可以简单地提取出来；而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之间的相互转化过程，泵浦光子的湮灭和斯托克斯光子的产生同时发生，但没有产生第三种光子；因此，通常用泵浦-探测技术中常见的调制解调的方式来提取信号，需要借助锁相放大器来实现。CARS 显微成像技术自 1999 年被发明以来，一直受困于非共振背景信号的干扰，典型的表现为光谱发生畸变（图 3）。在苦苦求索了近 10 年之后，谢教授课题组于 2008 年推出了 SRS 技术，地解决了上述问题。CARS 过程中能量被于电磁场/光子中，电子跃迁可绕过分子振动直接通过虚能级产生；而 SRS 的发生依赖于光子能量与分子振动之间的交换，具有严格的共振吸收特征。因此 SRS 在光谱上与自发拉曼一致（图 3），在图像上也不再受非共振背景的困扰（图 4）。此外，SRS 的信号与分子浓度呈线性关系，更方便于定量解析复杂混合物体系中的各种化学成分。也因为这些特性，SRS 不断获得研究者们的青睐。

▲图 3. 在 1595cm^-1处的 Raman、CARS 与 SRS 的光谱对比 [5]

▲图 4. CARS 与 SRS 对线虫内脂质成像 [6]

综上，CARS 与 SRS 都可以基于生物体中核酸、脂质和蛋白等物质自身的 Amide I、CH2、CH3 等化学键进行特异性成像。由于其免标记、高分辨率、快速成像以及三维扫描的优点，CRS 在病理检测、生物代谢、药物运输等方面具有广泛应用。具体的应用部分将在下一课堂详细讲解。

下面让我们先开启几个 CRS 的成像结果

▲图 5. SRS 对 Hela 细胞中的核酸、蛋白和脂质进行选择性成像 [7]

▲图 6. 小鼠脑肿瘤模型的受激拉曼成像。活体实验中，在（a）肉眼无法分辨肿瘤的区域；（b）受激拉曼技术可以清晰的探测到肿瘤边界；（c）离体鼠脑切片的 SRS 图像。蓝色代表蛋白丰富的肿瘤区域 [8]

▲视频 1.CARS 对皮肤癌囊块的三维层析扫描

▲视频 2.SRS 观察小鼠耳下血管内红细胞的流动

▲视频 3.SRS 观察在小鼠耳朵皮肤上的渗透过程

参考文献：

1.Alfonso-Garcia, A., Mittal, R., Lee, E. S. & Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. J Biomed Opt 19, 71407,

doi:10.1117/1.JBO.19.7.071407 (2014)

2.Cheng, J. X. & Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science350,aaa8870,

doi:10.1126/science.aaa8870 (2015).

3.He, R. et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica 4,

doi:10.1364/optica.4.000044 (2016).

4.Zumbusch, A., Holtom, G. R. & Xie, X. S. Three-Dimensional Vibrational Imaging by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering. Physical Review Letters 82, 4142-4145,

doi:10.1103/PhysRevLett.82.4142 (1999).

5.Freudiger, C. W. et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.Science 322, 1857-1861,

doi:10.1126/science.1165758 (2008).

6.Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G. & Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy.Nat Methods 8, 135-138,

doi:10.1038/nmeth.1556 (2011).

7.Lu et al., Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 112, E5902,

doi:10.1073/pnas.1515121112 (2015).

8.Ji, M. et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.Science translational medicine 5, 201ra119,

doi:10.1126/scitranslmed.3005954 (2013).

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作者简介

季敏标，男，1982 年出生于浙江省台州市。2001 年获北京大学物理系学士；2011 年获美国斯坦福大学物理系博士学位，研究方向为非线性光学和超快分子动力学；之后在哈佛大学谢晓亮组里从事博士后研究（2011-2014），发展相干拉曼成像技术并将其应用到肿瘤的无标记探测。2014 年入职复旦大学物理系担任研究员和博士生导师。2015 年入选中组部“”（青年组）和上海市“青年科技启明星计划”。

季教授的研究方向集中在非线性光谱学在物理、化学和生物医学等交叉学科中的应用，研究课题包括利用新型光谱显微成像技术研究生物医学问题，以及新材料的光电子特性研究等。迄今发表 SCI 论文 50 余篇，包括 Science, Science Translational Medicine, Science Advances, PNAS 等。并承担重点研发计划“数字诊疗装备”青年专项、基金委面上项目、上海市科技创新行动计划等多项科研项目。

作为一款成熟的商品化 CRS 产品，徕卡 TCS SP8 CARS 共聚焦显微镜可以简单快速地实现 CARS 无标记成像、单光子/多光子共聚焦荧光成像、二次（SHG）/三次（THG）谐波成像，或者使用红外、紫外激光进行的各种应用的成像，满足、多维度的高级生命科学研究需要。