细胞体外暴露方法的一个重要问题及CULTEX的优化方案

由于欧盟关于化学物质的毒性风险评估（REACH EC No.1907/2006）法规的改变，以及目前不断发展的替代方法的需求，以取代动物实验为目标，在体外模型基础上进行肺毒性的评估的技术，显然是非常有必要的。迄今为止，国内外的细胞体外毒性测试实验研究中，仍多采用浸没式细胞培养方法进行。然而，在浸没条件下的颗粒物暴露并不符合在细胞体内的真实情况，并可能影响研究受试物（颗粒物、气体等）的物理化学性质。早在1999年，德国Aufderheide教授便首先提出了细胞空气-液体界技术，并随后研制了专门的体外暴露设备的**代Cultex细胞暴露系统，用于对体外肺细胞在空气-液体界面直接进行各种受试物的暴露。这一系统符合细胞在空气-液体界面进行颗粒暴露的所有要求，从而初步成功的建立了受试物急性肺毒性评价的体外模型。

肺细胞在气-液界面暴露染毒技术模拟体内真实条件的同时，发现该方法可能出现一个严重的问题：洁净空气对照组的细胞存活率，与培养箱内细胞相比有明显降低（仅为培养箱内细胞存活率的40%~60%，如下图1）。此问题的出现意味着，实验组细胞损伤的原因更加复杂了，所获得实验数据的意义降低了。为此，如下文细胞体外暴露方法的一个重要问题及CULTEX的优化方案将予以详细介绍。

图1 图2

为了完善体外细胞气-液界面暴露方法，德国CULTEX^® Laboratories实验人员进行了大量改进性实验，通过对CULTEX 暴露模块结构、细胞培养选材、气路设计与气流控制、实验操作流程等多个方面（由于优化方案中所用方法及数据全部是根据CULTEX RFS的尺寸及气路设计进行大量实验基础上获得的，所以此方案仅适用于CULTEX RFS系统）进行调整优化处理：

实验材料：人肺腺癌上皮细胞系A549（CCL-185, ATCC）被用于暴露实验。A549细胞在Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基生长（DMEM）（Biochrom,Germany）含10%胎牛血清（FCS Gold, PAA Laboratories, Germany）和1%/（Gibco Life Technologies, Germany）。

实验中，A549细胞种在BD Falcon（PET膜，4.2 cm2, 孔径 0.4 μm, 孔密度 2.0 ± 0.2 × 106, BD Falcon, Germany）或者Corning Transwell（PET 膜, 4.67 cm2, 孔径 0.4 μm, 孔密度 4.0 × 106, Corning, Germany）细胞小室中，以密度1.2 × 105 cells/cm2，条件37 °C and 5% CO2 （标准条件）培养24h。

细胞体外暴露方法的一个重要问题及CULTEX的优化方案的优化方法：

1、 CULTEX RFS模块主要结构的优化

eq /o/ac(○,1)1 CULTEX RFS模块是细胞体外培养与暴露的核心结构，与**代的线性CLUTEX模块相比，RFS模块采用辐射流（Radial FlowSystem）结构，此结构不仅可以使颗粒物气溶胶在细胞表面沉积更均匀，重复性更高。同时，该结构在进气流分配、过载气流释放、废气气流排出上更加同步均一，便于统一控制气流压力；

eq /o/ac(○,2)2 系统优化了过载气体预排出通道的结构设计，该设计把系统过载气体排出对腔室内压力的影响降到*低，同时更可以把气体中可能混合的杂质一同排出，减少污染空气对细胞影响； eq /o/ac(○,3)3 气体喷嘴可替换，根据市售的不同品牌的tranwell小室，CULTEX对应开发了与之适用的气体喷嘴，减少气体因喷嘴与小室不适用而造成对细胞的压力； eq /o/ac(○,4)4 RFS暴露的开启和关闭，仅需要旋转开闭旋钮即可完成，不仅使系统的操作更简单、快捷，更重要的是其气密性更加完好，不会因操作漏气而对细胞的意外影响。

2、CULTEX RFS系统气体流量控制设计优化

CULTEX RFS系统的气流控制是通过真空+质量流量控制器进行的， eq /o/ac(○,1)1 CULTEX工程师们在对废气处理端加入两个气流缓冲结构； eq /o/ac(○,2)2优化出出*佳腔气体流量； eq /o/ac(○,3)3 优化出*佳通气压力。

3、CULTEX RFS模块操作流程优化

eq /o/ac(○,1)1 优化CULTEX RFS模块的开启和关闭的影响； eq /o/ac(○,2)2 膜底部的培养基是对细胞影响的*重要的因素，优化出其液面高度； eq /o/ac(○,3)3 优化模块的清洗方法及高压**影响。经过反复实验后，CULTEX^® Laboratories从以上三点进行了优化并提供成熟的标准操作程序。

4、细胞培养小室选择

细胞培养小室是细胞生长，气溶胶暴露的关键场所，CULTEX^® Laboratories发现：实验中随着暴露时间的持续，虽然洁净空气暴露组内细胞活性保持稳定，但是在BD Falcon小室内的细胞却表现出形态学上的不规则，尤其是小室位置的细胞，在30分钟的洁净空气暴露后更加明显(下图3 A)。为此，CULTEX^® Laboratories寻找并研制了适合RFS使用的*佳的小室，在洁净空气暴露30分钟后（下图3），细胞呈均匀分布形态良好，同时细胞存活率没有收到影响。

图3

总之，CULTEX^® Laboratories对Cultex RFS一系列优化后的实验结果表明，细胞体外暴露实验中洁净空气对照组的细胞存活率的影响是存在的，但可以通过大量的优化处理实验加以降低。细胞体外暴露方法的一个重要问题及CULTEX的优化方案中优化了的Cultex RFS系统进行A549细胞对清洁空气暴露方法的，也证明Cultex RFS技术是一种很好的替代学方法，是一个重要肺毒性细胞体外模型，对吸入毒理学的发展具有重要意义。

注：细胞体外暴露方法的一个重要问题及CULTEX的优化方案的文中，数据和资料均引自CULTEX® LaboratorieGmbH，关于CULTEX细胞体外暴露方法及优化方案的更多资料和数据请咨询德国CULTEX® Laboratorie或中国区技术服务中心北京佰乐良成科技公司。

*终使CULTEX RFS细胞暴露模块内的细胞存活率保持与培养箱内对照组基本相同并十分稳定（如细胞体外暴露方法的一个重要问题及CULTEX的优化方案中文图2）。