食物中胡萝卜素的测定方法

式中： X1--胡萝卜素标准溶液浓度，mg/ml；
A --吸光值；
E --β胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度1cm，溶液浓度为1ppm的吸光系数，为0.2638；

（注：配制标准溶液时，应注意标准品的结构是胡萝卜素还是胡萝卜素酯。通常标准品不能溶解于有机溶剂中，尤其是胡萝卜素酯，所以必要时应先将标准品进行皂化，再用有机溶剂提取，用蒸馏水洗涤至中性后，浓缩定容。再进行标定。由于胡萝卜素很容易分解破坏，所以每次使用前标准品均需标定，且测定样品时需带标准品同步操作。）
4.7 β-胡萝卜素标准工作液：将已标定的标准液用石油醚准确稀释，使每毫升溶液相当50μg，避光保存于冰箱中。
5.操作步骤
5.1样品的采集和处理
（1） 粮食：样品用水洗三次，置60℃烤箱中拷干，磨粉，储于塑料瓶中，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。
（2） 蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶中，冰箱内保存备用。
5.2测定步骤（以下步骤需在避光条件下进行）
（1）样品提取：取适量样品，相当于原样1～5g（含胡萝卜素约20～80μg）匀浆，粮食样品视其胡萝卜素含量而定，置100ml带塞锥形瓶中，加入丙酮20ml，石油醚5ml，振摇1min，静置5min，将提取液转入盛有100ml5%*溶液的分液漏斗中，再于锥形瓶中加入10ml丙酮--石油醚混合液，振摇1min，静置5min，将提取液并入分液漏斗中。如此提取2～3次，直至提取液无色为止。
植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品（<10g），加脱醛乙醇30ml，再加10ml1:1氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。
（注：原国标方法中，不是所有的样品均进行皂化处理。但是许多植物性样品由于细胞壁较厚，在匀浆或研磨过程中不易破坏，使胡萝卜素无法释放。并且尽管植物性样品中脂肪含量较少，但仍含有一定脂质成分，如果不进行皂化，会出现提取不和提取时出现乳化现象；浓缩时残留脂质，使定容体积不准确；纸层析展开不，造成测定结果偏移。所以建议除酒类、饮料外所有样品均进行皂化处理。）
（2）洗涤：将提取液静置分层，弃去下层水溶液，反复用5%*溶液振摇洗涤，每次约15ml，直至下层水溶液清亮为止。
将皂化后样品提取液用水洗涤至中性。
将提取液通过盛有10g的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。（注：经过辅助过滤，提取液中应不含水分。）
（3）浓缩与定容：将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60℃，蒸发至约1ml时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2.00ml石油醚定容，备层析用。
（4）纸层析
点样：在18cm×30cm滤纸下端距底边4cm处做一基线，在基线上取A、B、C、D四点，吸取0.100～0.400ml浓缩液（6.3）在AB和CD间迅速点样。（注意：保持滤纸干燥，点样应该快速细致，在基线上形成细窄直线）
展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。（注：层析缸应事先用石油醚饱和，并且防止水分进入。）
洗脱：待胡萝卜素与其他色素分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5ml石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素溶入试剂中。
（5）比色测定：用1cm比色杯，以石油醚调零点，于450nm波长下，测吸光度值，以其值从标准曲线上查出β胡萝卜素的含量，供计算时使用。
（6）标准工作曲线绘制：取β胡萝卜素标准使用液（浓度为50μg/ml）1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00ml，分别置于100ml具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行提取、洗涤、纸层析等操作，点样体积为0.100ml，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00μg。为测定低含量样品，可在0至2.50μg间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

6.计算

式中： X2--样品中胡萝卜素的含量，以β胡萝卜素计，mg.100g；
c --在标准曲线上所查得的胡萝卜素含量，μg；
V1--点样体积，ml；
V2--样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，ml；
m --样品质量，g。
7.注意事项
同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差优良值≤10%。

二、柱色谱法
1. 原理和适用范围
同纸层析法，只是将纸层析换成中性氧化铝柱层析。
2.试剂
（1） 中性氧化铝：80～100目。用前180℃烘干4小时至恒重。
（2） 其余试剂同纸层析法。
3.仪器及设备
（1）色谱柱：为1.0cm×25cm的玻璃柱，底端收缩变细，并有一活塞，用于调控液体流速；距底端上1cm处有一筛板，孔径为16～30μm。用前需干燥。
（2） 其余设备同纸层析法。
4.操作步骤
4.1样品采集和处理同纸层析法。
4.2测定步骤
（1） 样品提取、洗涤等步骤同纸层析法。
（2） 将洗涤后提取液浓缩并定容至10ml。
（3）柱色谱：将已干燥的中性氧化铝浸泡于石油醚中，以湿法填充色谱柱至高度为15cm，其上端加2cm无水Na2SO4，使石油醚自由流下，保证其水平高于Na2SO4平面0.5cm。（注意色谱柱填充时应避免水分，不要有气泡进入。）将样品提取液加入色谱柱上，自由流下，待提取液流至柱面时，分次加入石油醚2ml，洗涤柱壁，再加入石油醚洗脱，收集流出液至黄色带全部流出。流出液经60℃水浴减压蒸馏后，N2吹干，定容。
（4） 比色法测定同纸层析法。
5.注意事项
（1）柱色谱法的优点是在测定胡萝卜素的同时可测定其他类胡萝卜素和色素。类胡萝卜素、色素和胡萝卜素的极性不同，胡萝卜素极性*小先被极性小的石油醚洗脱，增加洗脱液极性（如加入、丙酮）可先后将极性稍大的类胡萝卜素（如叶黄素、叶红素）、叶绿色洗脱。
（2）纸层析法和柱色谱法均不能区分α-、β-和γ-胡萝卜素，虽然标准品为β-胡萝卜素，但实际结果为总胡萝卜素。不过天然食品中大部分为β-胡萝卜素，对结果影响不大。两种方法测定结果相当。
（3）HPLC的原理、适用范围、样品前处理及操作同纸层析法，浓缩定容后的样品液不经过纸层析，而进入HPLC的C18柱，经流动相洗脱后，用紫外分光光度计检测。HPLC可分离α-、β-胡萝卜素并可同时测定多种，是目前国内外常用的测定方法。但目前本实验室尚没有建立此法。